“点击化学”（Click chemistry），又译为“链接化学”、“动态组合化学” （Dynamic Combinatorial Chemistry）、“速配接合组合式化学”，是由化学家巴里·夏普莱斯（K B Sharpless）在2001年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键（C-X-C）合成为基础的组合化学新方法，并借助这些反应（点击反应）来简单高效地获得分子多样性。

点击化学应用于药物开发和生物医用材料等的诸多领域中，它已经成为目前很为有用和吸引人的合成理念之一。

一、点击化学的反应原理

点击化学指的是在一定环境条件（温和、含水）下，一对功能性基团彼此快速、有选择性地相互反应（“咔嚓”）。即两个相兼容的具有点击功能基团A和B被激活^[1-5]，被激活的两个分子形成稳定的偶联体。

形象比喻

}   “点击”意味着用这些方法把分子片段拼接起来就像将搭扣2部分“喀哒”扣起来一样简单。无论搭扣自身接着什么，只要搭扣的2部分碰在一起，它们就能相互结合起来，而且搭扣的2部分结构决定了它们只能和对方相互结合起来。

点击化学具有包括高选择性、合成反应快速、反应条件简单，不使用溶剂或在良性溶剂中进行，最好是水、副产物无害等优点，被广泛应用于生物学^[6-8]、药物开发^[9]和材料学^[10]等领域。

水相点击化学

1、点击反应容易在热水中发生——可能是由于有机物分子在水中有着很高的分离速率常数，增强其反应活性。

2、对环氧和氮杂环丙烷的亲核加成要求有氢键的环境，所以水是很好的溶剂。

3、对于烯/炔-点击反应，需要可极化的亲核/亲电试剂，而水分子可以很好地将难极化的分子和易极化的分子区分开来。

二、点击化学的反应特征

1、反应模块化。如叠氮和炔基都能生成含有三唑的化合物。

2、起始原料或反应物易得。

3、反应操作简单，条件温和，对氧气和水不敏感。

4、不需溶剂或用一些易于除去的溶剂，如水。

5、反应具有立体选择性，但不要求对映异构选择性。

6、产物易分离，后处理简单。反应收率高，副产物少。

7、产物在生理条件下稳定。

8、原料易的，高产率，区域/立体专一性。

三、点击化学的反应类型

特殊生物分子标记要求反应过程可在生理条件（中性ph、水溶液、室温）和低反应物浓度下进行，在适当的时间范围确保无毒性和低本底的标记，同时保留生物学功能。在多余的可能性反应中，一般只有少量符合反应的必要性、选择性和生物相容性条件。

点击化学归为两类：铜催化和无铜反应。

（1）铜（I）催化叠氮化物-炔烃反应（Cu(I)- catalyzed Azide - Alkyne Click Chemistry reaction，CuAAC）；

（2）力引发的的叠氮-炔基偶合反应（Strain-promoted Azide - Alkyne Click Chemistry reaction，SPAAC）；

（3）四氮杂苯-反式环辛烯连接反应（Tetrazine–trans- Cyclooctene Ligation，TCO）。

反应（1）依赖Cu（I）离子催化进行反应，而反应（2）和（3）可在无金属离子条件下进行反应。

比较知名的无铜叠氮化物-磷化氢反应（施陶丁格连接）由于受到磷化氢的不稳定性和反应迟缓的限制，目前研究重心主要转移到力引发的的叠氮-炔基偶合反应—TCO连接反应。

四、如何选择合适的点击化学反应？

一般来说，我们根据选择性、反应性、生物相容性和稳定性选择合适的点击化学反应。

1. Cu(I)-catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry (CuAAC) reaction^[1]

这是常用的反应，一个功能化的叠氮化物分子A和功能化末端炔烃分子B反应，通过一部分苯三唑形成稳定的A-B结合物（图2）。

由于末端炔烃与叠氮化物基本不会发生反应，CuAAC反应效率主要依赖金属催化剂，如带+1电荷的氧化态Cu（I）。也可使用不同的铜来源和还原剂，如与连接抗坏血酸的CuSO4 提供Cu(II) 盐也应用于大部分生物分之标记中^[11,12]。

CuAAC反应在活性细胞中的应用受到Cu（I）离子毒性的限制，通过使用Cu（I）螯合配体如THPTA可以解决这个问题，它可提供双重作用：（1）通过维持Cu（I）氧化状态促进CuAAC反应；（2）保护生物分子免受氧化性损伤。

如果你要开始建立和优化CuAAC反应体系，可参考Presolski ^[11] 和 Hong ^[12] 提供的通用方法。

特点：

ü   小型的叠氮化物和炔烃具有优良的底物性质

ü   试验适用条件的优化（类型&铜来源、还原剂和铜配体)

ü   适用于对铜毒性不碍事的实验(不推荐用于体内或活细胞标记)

反应速率较慢（相对其它两种反应）

2. Strain-promoted Azide-Alkyne Click Chemistry (SPAAC) reaction

铜离子的细胞毒性常常限制了CuAAC反应的应用。无铜离子和非毒性的叠氮化物标记方法是SPAAC反应^[3]，它通过使用相对末端炔具有显著减少活化能的环辛炔（strained cyclooctynes），因此不需要外源的催化剂^[13]。

 许多结构多种多样的环辛炔衍生物（如DIFO、BCN、DIBAC、DIBO、ADIBO）已经研制出来，在反应动力学和亲水性方面差异很大。我们的SPAAC结合化学是以杂氮苄基-环辛炔反应为基础的(ADIBO = DBCO = DIBAC)（图3）。

基于杂氮苄基-环辛炔(ADIBO=DBCO)的试剂具有高反应活性和足够的亲水性^[14,15]，因此低本底功能性叠氮化物分子标记^[16]甚至比CuAAC反应效率更高。而且叠氮化物-DBCO反应选择性高 ，因此理想地适合和四氮杂苯-反式环辛烯连接反应进行双重标记方法^[17]。

特点：

ü   检测小分子叠氮化物比CuAAC反应更快

ü   不需要铜离子，无毒性

ü   没有催化剂或者配体，因此无需大量的条件优化

ü   适合与四氮杂苯-反式环辛烯连接反应进行双标记方法

3. Tetrazine-trans-Cyclooctene Ligation

  四氮杂苯-反式环辛烯连接反应组成一种快速、无毒性生物分子标记方法，可理想的用于体内细胞标记和低浓度使用。一个功能化四氮杂苯分子A和一个功能化反式环辛烯（TCO）分子B反应，从而通过一部分二氢毗嗪形成一个稳定的A-B结合物（图4）。

一些结构多样的烯烃和四氮杂苯衍生物在反应动力学和稳定性方面具有很大的不同。TCO与四氮杂苯的反应活性较高^[18,19]。

四氮杂苯衍生物与TCO的反应活性取决于位置3（图4，R₁）和位置6 (图4，R₂)的取代基。目前已筛选出2种不同反应活性和稳定性的四氮杂苯，以满足不同的要求。如果快速反应动力学是主要因素，四氮杂苯 (R₁=phenyl, R₂=H) 试剂是理想的选择，而6-甲基-四氮杂苯 (R₁=phenyl, R₂=CH₃) 试剂则适用于化学稳定性要求较高的反应^[18]。

特征：

ü   快速点击化学反应，适合体内细胞标记和低浓度反应。

ü   无需铜离子，无毒

ü   无催化剂或者配体，不需大量的条件优化

适用于与力引发的叠氮-DBCO偶合反应^[17]

五、点击化学试剂的选择

Overview of available CLICK Reagents

Selected References

[1] Kolb et al. (2001) Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11):2004. [2] Sletten et al. (2009) Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angew. Chem. Int. Ed.48:6998. [3] Jewett et al.(2010) Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chem. Soc. Rev. 39(4):1272. [4] Best et al. (2009) Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry.48:6571. [5] Lallana et al. (2011) Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide–Alkyne Cycloadditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50:8794.

[6] Grammel et al. (2013) Chemical Reporters for biological discovery. Nature Chemical Biology 9:475. [7] Xie et al. (2013) Cell-selective metabolic labeling of biomolecules with bioorthogonal functionalities. Current Opinion in Chemical Biology 17:747. [8] Su et al. (2013) Target identification of biologically active small molecules via in situ methods. Current Opinion in Chemical Biology17:768. [9] Zeng et al. (2013) The Growing Impact of Bioorthogonal Click Chemistry on the Development of Radiopharmaceuticals. J Nucl Med 54:829. [10] Evans et al. (2007) The Rise of Azide–Alkyne 1,3-Dipolar 'Click' Cycloaddition and its Application to Polymer Science and Surface Modification. Australian Journal of Chemistry 60(6):3

[11] Presolski et al. (2011) Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology 3:153.

[12] Stanislav et al. (2009) Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48:9879.