问题

可能原因

解决办法

转膜不充分导致信号较弱

膜没有完全均匀湿透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10000

选择小孔径的膜，缩短转移时间

靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值

尝试使用其他缓冲液

甲醇浓度过高

降低甲醇浓度或者使用乙醇/异丙醇替代

转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白质需要延长转移时间

洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数

阻断不充分

增加封闭液孵育时间，或者提高温度。

二抗浓度过高

降低二抗浓度

检测过程中膜干燥

保证充分的反应液

曝光过度

缩短曝光时间

抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应

没有阳性条带或条带信号较弱

抗体染色不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间

酶活降低甚至失活

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内，有活性的酶联物

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因

试剂不匹配

一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性

一抗失效

选择在有效期内抗体，并选择现配现用的工作液

洗膜过度

缩短洗涤时间

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

抗体活性降低

选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置

蛋白转移不充分

见上述

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型

曝光时间过短

延长曝光时间

条带位置（大小）不对，或有非特异性条带

二抗的非特异性结合

增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）

一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性

蛋白降解

使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂，实验中增加内参

蛋白二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度

抗体浓度过高

降低抗体浓度，可以减少非特异性条带

蛋白上样量过大

降低样本上样量

背景斑驳

封闭剂中有聚集体

使用前过滤封闭剂

HRP耦联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂，去除聚集体

膜上出现反像

HRP含量过高

降低酶联二抗的浓度